干货 | 原来色谱柱长度对分离度影响这么大？实践告诉你不知道的秘密

色谱柱使用过程中你是否有遇到分离度的问题：

减小粒径，担心柱压太高？

增加柱长，担心分离度增加幅度太小？

来来，小编来教你一招

试试缩短柱长吧

既能提高分离度，还能降低成本

一、有趣的实验现象，有图有真相

       以三七含量测定为例，色谱柱柱长从250mm缩短为150mm，一起来看看谱图变化吧。

（1）Athena C18-WP  4.6 × 250mm, 5μm

（LAEQ-462572，三七含量测定）

（2）Athena C18-WP  4.6 × 150mm, 5μm

（LAEQ-461572，三七含量测定）

       综上，三七含量测定时，色谱柱柱长从250mm缩短为150mm，人参皂苷Rg1和相邻杂质峰的分离度从1.41增大到了1.74。

二、透过现象看本质，不违背基本规律

       通常较长的色谱柱，柱效更高，分离效果更好，而上述的实验现象是相反的，它是怎么发生的呢？我们来分析一下：

       流动相的梯度程序如下：

       从出峰时间，我们可以估算Rg1出峰时流动相的组成（流动相中乙腈的比例）：

       我们可以看出，和Athena C18-WP  4.6 × 250mm, 5μm相比，采用Athena C18-WP  4.6 × 150mm, 5μm，人参皂苷Rg1出峰时乙腈的比例更低，我们知道，反相色谱分离模式，降低流动相中有机相的比例，有利于提高分离度，而此时由于长度缩短、柱效降低引起的分离度下降起到次要作用，综合结果，分离度得到改善。

三、现实条件不满足，怎么办？

       如果我们手头没有150mm的色谱柱，实验又比较着急，我们还可以尝试提高流速的方法，下边还是以三七含量测定为例子，采用Athena C18-WP  4.6 × 250mm, 5μm，流速从1.0ml/min提高到1.2ml/min，人参皂苷Rg1出峰时间提前，出峰时乙腈的比例更低，人参皂苷Rg1和相邻杂质的分离度从1.41提高到1.52。

        温馨提示：此例子仅是为了提供一个思路，虽然通过改变流速，Rg1和相邻杂质峰分离改善，但同时引起Rb1受到杂质峰的干扰，此案例该方法不可行。

四、总结

       梯度洗脱时，遇到分离度问题，可以尝试缩短柱长或者提高流速的方法，此时是出峰时有机相比例降低造成的分离度提高和柱效降低引起的分离度下降的一个较量。如果前者起主要作用，分离度可以得到改善，如果后者起到主要作用，会导致分离度下降。

五、彩蛋时刻

       三七含量测定过程，经常会遇到分离度、基线漂移等问题，各个厂家也纷纷推出柱，采用安谱Athena C18 4.6 × 150mm, 5μm（LAEQ-461571），即可轻松实现柱的效果。

1. 良好的分离性能

       采用安谱实验Athena C18 4.6 × 150mm, 5μm（LAEQ-461571）色谱柱，按照2015版《中国药典》条件，做三七含量测定，三七皂苷R1的柱效远大于4000，人参皂苷Rg1和相邻杂质峰分离度达到2.1。

2. wan美的批次重现性

       采用3个不同批次的Athena C18 4.6 × 150mm, 5μm（LAEQ-461571）色谱柱，做三七含量测定，三七皂苷R1的柱效都远大于4000，三七皂苷R1的出峰时间以及人参皂苷Rg1和相邻杂质峰的分离度都能得到很好的重现。

3. 优异的稳定性

       采用Athena C18 4.6 × 150mm, 5μm（LAEQ-461571）色谱柱，做三七含量测定，连续进供试品溶液100针，三七皂苷R1的柱效、人参皂苷Rg1和相邻杂质峰的分离度保持稳定，Athena C18 4.6 × 150mm, 5μm（LAEQ-461571）色谱柱具有优异的稳定性。