食品中氯丙醇酯、缩水甘油酯测定的整体解决方案Ⅱ—— GB 5009.191-2024

在酸性溴化盐溶液中，3-氯丙醇酯转化为3-氯丙二醇（3-MCPD）单酯、2-氯丙醇酯转化为2-氯丙二醇（2-MCPD）单酯、缩水甘油酯转化为3-溴丙二醇（3-MBPD）单酯。随后，在酸性甲醇溶液中3-MCPD酯、2-MCPD酯和3-MBPD酯转化为氯丙醇和溴丙醇，酸水解得到的溶液经碳酸氢钠溶液中和后，通过硅藻土小柱进行净化，使用七氟丁酰基咪唑对3-MCPD、2-MCPD及3-MBPD进行衍生，气相色谱-质谱检测，内标法定量。

实验用到的标准品信息见下表：

表1 标准品信息

2.1 标准品溶液配置

氯丙醇酯、缩水甘油酯混合标准中间液（10 μg/mL）：分别准确移取1 mL 100 μg/mL 3-MCPDE、2-MCPDE、GE标准溶液至10 mL容量瓶中，用甲苯定容至刻度。于-20℃保存，保存期6个月。

氯丙醇酯、缩水甘油酯混合标准工作液CaL I（2 μg/mL）：准确移取1 mL 10 μg/mL 氯丙醇酯缩水甘油酯混合标准中间液，用甲苯定容至5 mL。于-20 ℃保存，保存期 3个月。

氯丙醇酯、缩水甘油酯混合标准工作液CaL II（0.2 μg/mL）：准确移取1 mL 2 μg/mL 氯丙醇酯缩水甘油酯混合标准中间液I，用甲苯定容至10 mL。临用现配。

内标混合标准工作溶液（D5-3-MCPDE:2µg/mL，D5-2-MCPDE:2µg/mL，D5-GE：2µg/mL）：分别准确移取0.4 mL 50 μg/mL D5-3-MCPDE、D5-2-MCPDE和D5-GE标准溶液到10 mL容量瓶中，用甲苯稀释至刻度。于-20 ℃保存，保存期 3个月。

2.2 标准曲线配制

配制氯丙醇酯和缩水甘油酯标准曲线，取 5 支 8 mL玻璃螺纹样品瓶中，分别加入 2 mL 四氢呋喃，再准确加入 100 μL 混合内标工作液（2.00 µg/mL），涡旋混匀后，按照下表加入混合标准工作溶液，按照“样品前处理"进行后续操作，上机检测得到标准曲线。

表2 氯丙醇酯、缩水甘油酯标准曲线的配制

标准品配制注意事项：

1、氯丙醇酯浓度均以对应的氯丙醇计，缩水甘油酯浓度以缩水甘油计，定量计算中需特别注意。

2、如使用纯品型标品，需注意计算标品的纯度和对应的折算系数。建议选择安谱璀世溶液型标品，进行稀释配制，操作更加方便。

试剂配置：

0.7%酸性溴化钠溶液：称取1.0 g溴化钠，加入10 mL水溶解，混匀；从中取出1.0 mL，加入1.0 mL硫酸和12 mL水，混匀，有效期1个月。

碳酸氢钠溶液（0.6%）：称取0.6 g碳酸氢钠。加入80 mL纯水，溶解后转移至100 mL容量瓶中，纯水定容至100 mL，临用现配。

饱和碳酸氢钠溶液（9.6%）：称取9.6 g碳酸氢钠。加入100 mL纯水，加热溶解后，降至室温，溶液中存在沉淀，临用现配。

硫酸-甲醇（1.8%）：吸取1.8 mL硫酸于100 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，建议临用现配。

乙_醚-石油醚溶液（1+1）：量取乙_醚和石油醚各100 mL，混匀。

试样提取：

准确称取婴幼儿配方奶粉试样0.5 g（精确至1 mg）于40 mL玻璃螺纹样品瓶中，准确加入100 µL混合内标工作液（2 µg/mL）；加入2 mL 65 ℃±5 ℃水，涡旋混匀，再加入1 mL氨水，盖塞涡旋混匀，在65℃±5℃水浴下振荡30 min，取出后冷却至室温。加入3 mL乙醇，涡旋后加入5 mL乙_醚，振摇5 min，然后加入5 mL石油醚，继续振摇5 min。待溶液静置分层后，取上层溶液于40 mL玻璃样品瓶中；再加入乙_醚和石油醚各5 mL，重复萃取1次，合并有机相于40℃下氮吹浓缩至1mL左右，待净化。

脂肪的净化：

将上述待净化溶液转移至活化后的氨基固相萃取柱【SBEQ-CA2154，500 mg/6 mL 小柱临用前用6mL正己烷-乙酸乙酯(85+15)溶液活化】中，加入12mL正己烷-乙酸乙酯(85+15)溶液洗脱，收集全部流出液及洗脱液，于40 ℃下氮吹至干，供溴代反应。

溴代反应和酸水解：

向提取样品中加入2 mL四氢呋喃，涡旋混匀后，再加入30 μL 0.70%酸化溴化钠溶液，混匀后，于50℃下放置15 min进行溴代反应。结束后加入3 mL 0.60%碳酸氢钠溶液中和，涡旋30 s。加入3 mL正己烷萃取，充分涡旋，静置待溶液分层后，取上层溶液在40℃下氮吹至干，加入1 mL四氢呋喃复溶。

于上述复溶溶液中加入1.8 mL 1.8%硫酸-甲醇溶液，涡旋混匀，于40℃下水解约16 h，结束后加入0.50 mL 9.6%碳酸氢钠溶液中和，涡旋，将溶液在40 ℃下氮吹至体积为1 mL~1.5 mL；溶液供净化。

试样净化：

将上述中和后的水解液全部转移至硅藻土小柱（SBEQ-CA3918-MCPD，5 g/60 mL）上，放置10 min，然后用25 mL正己烷淋洗，弃去淋洗液，再用35 mL二氯甲烷洗脱。

收集洗脱液，加入10 g脱水剂（无水硫酸钠和无水硫酸镁各5 g），溶液放置至少30 min，期间不时振摇4次~5次，以彻_底脱水；将溶液转移至40 mL玻璃螺纹样品瓶中，于40℃水浴氮吹浓缩至约0.5 mL，将浓缩液转移至20 mL顶空瓶中，用2 mL正己烷分两次淋洗螺纹瓶内壁，洗液一并转入顶空瓶中，待衍生。

衍生化反应：

于净化后浓缩液中，用气密针快速加入0.05 mL七氟丁酰基咪唑，立即压盖，涡旋30 s后，于70 ℃保温20 min。衍生结束后取出顶空瓶，冷却至室温，加入2 mL 20%氯化钠溶液，充分涡旋使上层溶液澄清，静置使水相和正己烷分层，取上层溶液至装有约0.3 g无水硫酸钠的玻璃样品瓶中，涡旋混匀10 s，提取液过0.22 μm的疏水性PTFE针式滤器后供气相色谱-串联质谱仪进行测定。

前处理注意事项：

1、前处理过程中尽量避免使用塑料耗材，可使用玻璃小柱、玻璃螺纹瓶、玻璃巴斯德吸管、玻璃移液管、手动进样针等耗材，建议进行方法空白实验监控过程本底情况；

2、七氟丁酰基咪唑易吸水，建议低温干燥保存（可放于含有干燥剂的袋子中然后置于冰箱保存），建议临用前从冰箱拿出；

3、衍生反应需在密闭性良好的带盖玻璃管中进行，建议使用顶空瓶进行；

4、建议使用疏水性PTFE针式滤器进行过滤。

仪器维护注意事项：

1、随着进样次数的增加，仪器轻微污染，目标物保留时间可能发生偏移；

2、该实验对仪器污染比较严重，仪器受到严重污染后，可能导致目标物响应降低、分离度变差等情况，需注意仪器的清洗维护，包括进样针的清洗，离子源的清洗，色谱柱的老化等；

3、如仪器配制程序升温进样口和反冲功能，可明显降低对仪器的污染程度。

4、建议色谱柱加装2m 相同固定相的预柱，定期对预柱进行更换，可延长色谱柱的使用寿命。

6.1 标准曲线数据

以标准品与内标的质量为横坐标，目标物与其对应内标的峰面积比为纵坐标，绘制标准曲线。3-MCPDE、2-MCPDE、GE的标准曲线和相关系数见下表：

表4  3-MCPDE、2-MCPDE、GE的标准曲线

6.2 加标回收率数据

本次实验方法空白未检出氯丙醇酯和缩水甘油酯，奶粉样品中3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和缩水甘油脂肪酸酯的本底含量分别为0.028、0.013、0.007 mg/kg。

奶粉样品中3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和缩水甘油脂肪酸酯的加标回收率数据见下表。

表5  奶粉基质的加标回收率数据（n=3）

数据计算注意事项：

1、本实验3-氯丙醇酯使用D5-3 -氯- 1,2-丙二醇棕榈酸双酯作为定量内标；2-氯丙醇酯使用D5-2-氯-1,3-丙二醇硬脂酸双酯作为定量内标；缩水甘油酯使用D5-缩水甘油棕榈酸酯作为定量内标；酸水解方法中3 -氯- 1, 2-丙二醇酯不会转换成缩水甘油（Gly），因此不影响缩水甘油酯含量的计算。

使用安谱实验标准品和相关耗材，参照国标《GB 5009.191-2024 食品安全国家标准 食品中氯丙醇及其脂肪酸乙酯、缩水甘油酯的测定》第二篇第二法，对酸水解方法，使用同位素内标法进行定量，3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和缩水甘油脂肪酸酯的回收率在90%-110%之间，RSD小于13%。该方法操作简便，最然时间较长，但缩水甘油酯含量不受氯丙醇转换影响，方便理解。安谱实验标准品和相关耗材能够很好的满足奶粉基质中氯丙醇酯和缩水甘油酯的检测。